DNA parmakizi; DNA parçalarının elektroforez sonunda oluşturduğu bantlardır ve bu bantlar protein, DNA veya RNA olabilir. Elde edilen bantlar bireye özgüdür ve bireyin genetik yapısının tanımlanmasında ve akrabalarının tespitinin gerektiği durumlarda kullanılabilir. Her canlının –tek yumurta ikizleri hariç- DNA yapısı bireye özgüdür ve bu benzersizlik canlının genetik yapısının moleküler genetik metotlarıyla tespit edilebilmesini sağlar. Canlıların genetik yapılarını tespit etmeye yarayan bu metotlara DNA Parmakizi (DNA Fingerprinting) yöntemleri adı verilmektedir. Bu yöntemler günümüzde en çok adli tıpta, ebeveyn testlerinde, tıpta teşhis koyucu tanıda, bitki ve hayvan bilimlerinde çeşitlilik ve akrabalığın tespitinde, yabani formların araştırılmasında güvenilirlikle kullanılan analizler haline gelmiştir. DNA Parmakizi Analizi esnasında canlının genetik yapısını tanımlamak amacıyla kullanılan doğal yada sentetik bileşenlere DNA markeri (belirteci) adı verilmektedir. Günümüzde DNA Parmakizi Analizinde kullanılan belli başlı DNA markerlari mikrosatellitler, CR-1 (chicken repeat) genler, ev (endogenöz virüs) genleri, sentetik oligonükleotid primerleri ve benzerleridir. Bu markerler iki temel analiz metodu olan RFLP ve RAPD-PCR teknikleri ve bunların kombinasyonlarıyla incelenebilirler. RFLP ve RAPD-PCR yöntemlerini kısaca inceleyecek olursak; 1) RFLP (Restrıctıon Fragment Length Polymorphısm- Restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi): Restriksiyon enzimleri (RE) DNA ekseninde belli bir nükleotid sırasını tanıyıp kesim yapar ve ikiye ayırır. Bir makas gibi işlev gören restriksiyon enzimleri rekombinant DNA teknolojisinde önemlidir. İlk restriksiyon enzimi Hamilton Smith tarafından keşfedilen HindIII enzimidir. Bu keşif Rekombinant DNA tekniğinin daha sonraki gelişimlerinin anahtarı olmuştur. 200 den fazla farklı bakteri türünden yüzlerce restriksiyon enzimi bulunmuştur ve her enzim orijini olan bakterinin kısaltmasıyla beraber bulundukları sıraya göre Romen rakamlarıyla adlandırılırlar. Kesim bölgesi genelde 5-10 dizilik bir bölgedir. Sonuçta rekombinant DNA teknolojisinde önemli yapışık uçlar veya kesik uçlar oluşur. Restriksiyon enzimlerinin kesim sonucunda oluşturduğu parçalara restriksiyon parçaları denir. DNA molekülü farklı kesim bölgelerine sahip olabilir. Değişik enzimlerle muamele sonucunda farklı uzunluklarda restriksiyon parçaları oluşur ve bu parçalar jel elektroforezi yoluyla birbirlerinden ayrılabilirler. Aynı RE farklı sayıda bireye uygulandığındanda, bireylerin genetik yapıları birbirinden farklı olacağından değişik miktar ve uzunlukta parçalar oluşur. DNA parçalarında görülen bu polimorfizmin nedeni nokta mutasyonu olabileceği gibi, inversiyon, delesyon, translokasyondan kaynaklanan büyük mutasyonlarda olabilir. Kısaca; RFLP analizinde restriksiyon enzimlerinin DNA daki kesim noktalarında ki değişmelerden faydalanılır. Kullanılan ana yöntem SOUTHERN BLOT HİBRİDİZASYONU dur. Southern Blot Hibridizasyon yöntemi: 1) Genomik DNA nın izolasyonu: DNA izolasyonunda bir çok yöntem vardır. Araştırıcı yeteneklerine ve laboratuarın olanaklarına göre uygun olanını seçmelidir. Fiziksel ve kimyasal işlemlerle DNA haricindeki komponentler ortamdan uzaklaştırılır. 2) Spesifik restriksiyon enzimiyle kesim: Saf haldeki DNA eppendorf tüpüne konduktan sonra 0.5-5 g arasında RE ilave edilerek genelde 37C de 4-6 saat inkübasyona bırakılır. Bu esnada RE DNA yı belli noktalardan keser ve büyüklü küçüklü parçalar oluşturur. 3) Elektroforez: DNA solüsyonu Agaroz jelde veya PAGE de bir süre gerekirse bir gece 40-50 volt altında bırakılır. Akım jelin kalınlığına göre ayarlanır. Büyük parçalar, başlangıç yerinde, küçük parçalarsa jelin sonunda toplanır. Jel ethidium bromıde ile boyanırsa bantlar U.V altında görünür hale gelir. Eğer enzim iyi çalışmışsa 20 kb. dan büyük yüzlerce parça oluşabilir. 4) Southern Blot Bantlarının (DNA) membrana transferi: Elektrotransfer, alkali, kapillarite vb yöntemlerle parçalar naylon membrana alınırlar. Naylon membranlar sağlamlıkları, tekrar tekrar kullanılabilmeleri kuvvetli fiksasyon özellikleri nedeniyle günümüzde tercih edilmektedirler. Transfer sonunda membran kurutulur. 0.5 NaOH ile DNAlar denatüre edilir ve membran 80C ye ısıtılarak DNA ları fiksasyonu sağlanır. 5) Melezleme (Hibridizasyon): Naylon membran önce ön solüsyonla yıkanıp kurutulur ve üzerine radyoaktif işaretli bir probun ilavesiyle melezleşme sağlanır. 24 saatin sonunda denatüre tek iplikçikli DNA lar probla birleşir ve membran yıkanarak melezleşmemiş DNA lar ve artıklar temizlenir. Otoradyografik yöntemlerle görüntülenir. 2) RAPD-(Randomly Amplıfıed Polymorphıc DNA-Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA): 1990 yılında iki araştırmacı grubu Welsh ve McLeland ile Williams ve ark. özgül nükleotid dizisini bilmeye gerek kalmadan PCR ile rasgele bir primer kullanarak polimorfizmin saptanabileceğini buldular. Literatüre RAPD olarak geçen bu yöntemle büyük bir polimorfizm kısa zamanda ve kolayca saptanabilir. Pikogram düzeyindeki DNA miktarları bile PCR yönteminde başlangıç yeterlidir.Eldeki düşük miktardaki DNA ile mikrogram seviyesine ulaşmak mümkündür.Kısa bir süre içinde DNA on milyon kezden fazla in-vitro olarak çoğaltılabilir. Bu teknikte rasgele primerler genomik DNA nın çeşitli bölgelerini çoğaltmada kullanılır.Oligonükleotid primerleri polimeraz zincir reaksiyonunun anahtarıdır. Oluşan parçaların sayı ve büyüklüğü; primerin nükleotid dizisine ve kalıp DNA da bu diziye komplamanter dizinin varlığına bağlı olarak araştırılan genoma özgü bir desen (pattern) verir. RAPD nin temelindeki teknik PCR metodudur. PCR; DNA bölgelerinin, rasgele oligonükleotid primerleri ve DNA polimeraz enzimi aracılığıyla milyonlarca kez çoğaltılması işlemidir. En önemli özelliği kan, tükürük, kıl, saç, doku parçaları, sperm vb örneklerden picogram seviyesinde DNA miktarının bile başlangıç için yeterli olmasıdır. Teknik, bir seri tekrarlanan replikasyon döngülerini içerir. Replikasyon döngüsü üç aşamadan oluşmaktadır. 1) PCR Aşamaları: a) DNA nın denatürasyonu: 92-95C de çift iplikçikli yapı denatüre olup, tek iplikçikli hale geçer. 1-5 dakika yeterlidir. b) Primerlerin bağlanması: Primerler sentetik olarak hazırlanan 15-30 bazlık oligonükleotidlerdir .Rastgele seçilirler ve kendine komplamanter bölgeyi bulup tutunurlar ve DNA sentezinin ilerlemesine basamak olurlar.30-35C sıcaklıkta primerler komplamenteri olan denatüre tek iplikçikli DNA nın 3 ucuna tutunur ve 3-5 boyunca bağlanır. Bağlanma süresinin bitiminde 70-72C sıcaklıkta Taq polimeraz .......